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    牛胚胎移植技術規程
    來源:通遼市家畜繁育指導站 | 作者:通遼市家畜繁育指導站 | 發布時間: 2014-12-19 | 6206 次瀏覽 | 分享到:

    1 范圍

    本標準規定了牛胚胎移植的主要技術。包括供體牛選擇、超排處理、人工授精、胚胎收集、受體牛準備、移植、妊娠診斷等。

    本標準適用于通遼地區養牛場(戶)。

    2 規范性引用文件

    下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

    NY/T 815 肉牛飼養標準

    DB1505/T 065 科爾沁肉牛獸醫防疫準則

    DB1505/T 067 牛冷凍精液人工授精技術規范

    DB1505/T 074 牛妊娠診斷規程

    3 術語和定義

    下列術語和定義適用于本標準。

    3.1 供體

    提供胚胎的母牛。

    3.2 受體

    接受胚胎并代之完成妊娠、分娩、哺乳犢牛的母牛。

    3.3 同期發情

    同期發情又稱同步發情,就是利用某些激素制劑人為地控制并調整一群母畜發情周期的進程,使之在預定時間內集中發情。

    3.4 超數排卵

    在母牛發情周期的適當時期,注射促性腺激素,使卵巢上比自然生理狀態下有更多的卵泡發育并排卵的方法簡稱超排。

    3.5 沖胚

        利用沖卵液將胚胎沖出,并收集在器皿中。

    3.6 檢胚

        指對沖出的胚胎的完整性、活力進行形態學檢測并鑒定等級。

    4 供體牛的選擇標準

    4.1 譜系清楚,生產性能優良,種用價值高。

    4.2 繁殖性能良好,有連續2個或2個以上正常發情周期。

    4.3 營養狀況好,膘情中上等。

    4.4 無生殖系統疾病和傳染性疾病。

    4.5 與配種公牛必須是經過后裔測定的優秀個體,育種值排名靠前。

    5 受體牛的準備

    5.1 受體牛選擇

    可選擇生長發育正常、健康無病、乳房發育良好、繁殖力較強、體格適中的母牛,最好是經產母牛。

    5.2 組群

    5.2.1 外購受體牛應來自非疫區,并經獸醫部門檢疫合格的健康空懷母牛。

    5.2.2 外購母牛隔離、免疫、驅蟲執行DB1505/T 065。

    5.2.3 受體牛佩戴耳標。

    5.3 受體牛的飼養管理

    5.3.1 受體牛的飼養標準參照NY/T 815。

    5.3.2 詳細觀察受體牛的日常行為、發情狀況、健康狀態。

    5.4 受體牛的同期發情

    5.4.1 受體牛的發情時間與供體牛超排后的發情時間應確保一致,前后不超過1d。

    5.4.2 同期發情方法

    前列腺素(PGF)法:一次注射法是在發情周期的第9d注射PGF,通常在2d3d內發情。在不清楚發情周期的情況下采用兩次注射法,即第一次注射后間隔10d12d再進行第二次注射。約90%于注射后24h48h發情。

    孕激素法:每日肌注或口服孕酮類似物如氯前列烯醇(PGC2ml0.2mg。處理12d18d,停藥2d3d后出現發情。

    5.4.3 受體牛發情鑒定方法與供體牛相同。

    6 供體牛的超排處理

    6.1 通常采用促卵泡素(FSH+前列腺素(PG)法。

    6.2 程序

    供體牛發情后的第9d13d 肌注FSH,以日遞減法連續注射4d,每天早晚等量注射2次(每隔12h),使用總劑量按照牛的體重、胎次作適當調整。詳見表1。

    1 發情9d13d超排處理及藥物劑量表

     

     

    起始注射量(mg

    連續注射4d每日遞減(mg

    經產牛

    育成牛

    FSH

    國產

    810

    68

    0.20.4

    進口

    300400

    200300

    20

    1(續)

    PG

    氯前列烯醇

    肌注

    注射FSH 56針后

    0.40.6

    子宮灌注

    注射FSH 56針后

    0.20.3

    超排藥品的劑量和比例應根據不同廠家和批號作調整。

    7 供體牛的人工授精

    7.1 發情鑒定

    供體牛超排處理后,一般12h48h出現發情征兆。發情鑒定執行DB1505/T 067。

    7.2 配種

    執行DB1505/T 067。

    8 胚胎收集

    8.1 方法

        采用非手術法。

    8.2 準備

    8.2.1 回收胚胎在配種后6d8d進行。沖胚前一天開始停飼并限制飲水,以減輕沖胚操作時腹壓和瘤胃壓力的影響。

    8.2.2 準備好沖胚器械和沖卵液。沖卵液使用杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBSS,其成分和配方見附錄A。

    8.3 供體牛的保定與消毒。

        保定供體牛,用2%鹽酸利多卡因或普魯卡因進行薦尾椎硬膜外麻醉,用18號針頭,每頭牛約5ml。應將外陰部及陰唇清洗消毒,再用消毒過的紙巾擦干。

    8.4 胚胎回收

    8.4.1 固定沖卵器

        供體牛尾部麻醉后,操作者一只手伸入直腸握住子宮頸,另一只手持內管穿插有金屬探針的雙通式或三通式導管沖卵器,使其依次通過陰門、陰道、子宮頸和子宮體,最后頭部抵達一側子宮角的基部。然后通過充氣孔充氣15ml20ml,使其頭部的氣囊膨脹以固定在子宮角內腔的基部,以免沖卵液流入子宮體并沿子宮頸流出。

    8.4.2 注入沖卵液

    D-PBSS 沖卵液吊瓶掛在距母牛外陰上方0.8m1m高處,接三通管和沖卵管,用進流開關和出流開關控制流量,每次灌注30ml50ml D-PBSS沖卵液,單側總量為300ml500ml。也可用50ml一次性注射器分次注射和抽吸(劑量為30ml50ml),具有相同的沖排效果。另側子官沖胚時應先重新插入鋼芯和放氣,將其移入另側子官角后用同樣方法沖胚。沖胚結束后放氣,將采卵管移入子宮體后,在子宮體推注抗生素(如土霉素100IU 或宮乳康10ml20ml),肌注氯前列烯醇(PGC0.4mg,間隔12h 后再用0.4mg。

    9 胚胎檢查

    9.1 檢胚

    采用漏斗法接收回收液,靜置10min,等胚胎下沉后移去上層液,可將最后留在斗中的回收液倒入玻璃皿中直接撿胚,撿到胚胎應及時移入含有10%20%犢牛血清的D-PBSS培養液中;進行凈化處理,對回收的胚胎進行形態學鑒定確定等級。

    從回收液中撿胚可用實體顯微鏡放大16倍~20倍。將找到的胚胎用吸管撿出放入裝有D-PBSS保存液的器皿中,按順序依次輕輕吸胚、清洗,可先吸些D-PBSS吹向胚的周圍,使胚在液滴中翻騰,清除卵周圍的黏連物,一般需清洗3次。

    9.2 胚胎質量鑒定

    9.2.1 將凈化后的胚胎置于D-PBSS液中,放大40倍~200倍作形態學檢查。胚齡通常以母畜發情日為0天來計算,距發情日的天數即為胚齡。

    9.2.2 胚胎發育特征

    適于移植的胚胎胚齡為6d8d,相對應的胚胎發育階段為桑椹胚至囊胚,其發育表現為:

    9.2.2.1 桑椹胚 

    受精后第5d6d 回收的胚胎,能觀察到球狀細胞團,分不清分裂球,占據透明帶內腔的大部分。

    9.2.2.2 致密桑椹胚 

    受精后第6d7d 回收的胚胎,細胞團變小,占透明帶內腔的60%70%。

    9.2.2.3  早期囊胚 

    受精后第7d8d 回收的胚胎,細胞的一部分出現發亮的胚泡腔,細胞團占透明帶內腔的70%80%,難以分清內細胞團和滋養層。

    9.2.2.4 囊胚 

    受精后第7d8d 回收的胚胎,內細胞團和滋養層界限清晰,胚泡腔明顯,細胞充滿透明帶內腔。

    9.2.2.5 擴張囊胚 

    受精后第8d9d 回收的胚胎,胚泡腔明顯擴大,體積增至原來的1.2倍~1.5倍,與透明帶之間無空隙,透明帶變薄,相當于正常厚度的1/3。

    9.2.2.6 孵育胚 

    透明帶破裂,細胞團孵出透明帶。

    9.2.3 胚胎的分級

    9.2.3.1 1級 優良胚胎:形態典型,卵細胞和分裂球的輪廓清晰,細胞質致密,色調和分布極均一。

    9.2.3.2 2級 普通胚胎:與典型的胚胎相比,稍有變形,但卵細胞和分裂球的輪廓清晰,細胞質較致密,分布均勻,變性細胞和水泡不超過10%30%。

    9.2.3.3  3 不良胚胎:形態有明顯變異,卵細胞和分裂球輪廓稍不清晰,或部分不清晰,細胞質不致密,分布不均勻,色調發暗,突出的細胞、水泡和變性細胞占30%50%。

    9.2.3.4 4 凡總體形態結構不正常的卵子,未受精的、退化的或破碎的卵子,透明帶空的或將要空的卵子,以及與正常胚齡相比,發育遲2d2d以上的胚胎均難以繼續正常發育,不宜移植。

    10 胚胎的裝管、冷凍和解凍

    10.1 裝管

    10.1.1 采用一步平衡法,

    冷凍保存液為含10%甘油的D-PBSS液。將胚胎在基礎液(PBS10%BSA 沖卵液)中洗滌5次~10次,在10%甘油第1液中平衡5min,在10%甘油第2液中平衡10min后裝管。

    注:10BSA 沖卵液:含10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗

    10.1.2 胚胎裝管方法:

    將平衡好的胚胎用0.25ml 細管裝管備用。3 段法裝管的順序是:3cm 12.5%蔗糖PBS液、0.5cm氣泡、1.0cm10%甘油PBS液(含胚胎)、0.5cm氣泡、2cm12.5%蔗糖PBS液。用封口塞、聚乙醇粉末封口或熱封法將開口端封口,按程序進行冷凍。

    10.2 冷凍

    將裝入胚胎的細管放入0℃冷凍儀平衡10min,以1℃/min速度降溫,(-7-6誘發結晶,平衡10min。隨后將冷凍儀以0.5℃/min (O.3O.8℃/min)降至-30℃,然后將冷凍后的胚胎分裝標記放入液氮罐中長期保存。

    10.3 解凍

    從液氮罐中取出胚胎細管,在空中停留1s,放入3638℃水浴中停留10s解凍后,用生理鹽水清洗,剪去棉塞端,與帶有空氣的1ml注射器連接上。再剪去細管的另一端封口,將胚胎推到干燥潔凈器皿內。采用分步法脫除甘油,分別間隔5min,依次通過1摩爾、0.75摩爾、0.50摩爾、0.25摩爾的甘油磷酸鹽緩沖液,最后通過含10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液洗2次~3次,去除甘油,移至不含甘油的PBS保存液中鏡檢待用。

    10.4 胚胎細管標記

    胚胎細管應標記和登記。存檔資料包括胚胎系譜、代碼、保存方法、應用單位。胚胎標記包括序列號、父本、母本、胚胎發育期和級別及數量、胚胎生產單位和胚胎生產日期。

    11 胚胎移植

    分為鮮胚移植和凍胚移植。

    11.1 受體牛黃體檢查

        要求受體牛發情時直腸檢查的卵泡直徑在10mm20mm左右,發情后36h出現排卵。黃體發育達到一級和二級發育水平的才能進行胚胎移植。黃體發育程度判定條件如下:

    11.1.1 一級黃體

    黃體形態和發情天數一致,黃體呈乳頭狀突出于卵巢表面。黃體直徑2.0cm左右,約拇指大小,呈軟肉狀,排卵點火山口狀突起明顯。

    11.1.2 二級黃體

    黃體形態和發情天數基本一致。黃體直徑1.5cm 左右,約中指肚大小,呈硬肉狀,排卵點突起較明顯。

    11.1.3 三級黃體

    黃體直徑1.0cm 左右,手摸約小拇指大小,硬而突起不明顯。黃體發育不良的母牛應及時淘汰。

    11.2 受體牛的準備

    保定受體牛,清除便污,肌注2%靜松靈1ml或用2%的普魯卡因3mll2尾椎間硬膜外麻醉。清洗外陰,用高錳酸鉀水沖洗消毒,用滅菌紙擦干,最后經酒精棉球消毒。

    11.3 器械準備

    先將移植槍、槍頭及金屬保護外套分別用紙包扎好,高壓消毒。塑料卡蘇式移植槍需經氣體滅菌。移植時先用70%酒精棉球消毒裝有胚胎的塑料吸管,然后剪掉封口一端,裝入移植槍內,套上保護外套。

    11.4 移植前胚胎裝管

    0.25ml吸管分三段吸入PBS保存液,中間由兩個氣泡隔開,中段含有胚胎。也可用小汽泡分成多段裝管,胚胎在中段。一步吸管法解凍脫甘油后,用酒精棉球多次消毒吸管,剪去封口即可用于移植。

    11.5 移植

    操作員一只手伸進直腸,另一只手持移植器插入陰道,移植器到達子宮頸口時,用力將移植槍捅破外套填片,插入子宮頸。在直腸內誘導使槍頭輕輕穩妥地插入黃體一側子宮角至大彎處,持移植器的手推出胚胎,緩慢旋轉地抽出移植槍。

    12 妊娠診斷

    采用外部觀察法和直腸檢查法,執行DB1505/T 074。

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